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          如何使用超濾管進行蛋白濃縮和更換Buffer

          發布時間:2019-12-19 點擊次數:5375次
            蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,選擇合適的超濾管,主要考慮MWCO和濃縮體積,通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。
            使用前加入MilliQ水,水量完全過膜,冰浴或冰箱里預冷幾分鐘。然后將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂的白線為準。操作要輕,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預冷。當濃縮到剩下1ml時,取50ul國產Bradford溶液,加入10ul流穿,看有沒變藍色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要判斷是否漏管,用5mg/ml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測,繼續加入剩下的蛋白液濃縮直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉淀,導致堵管。若發生沉淀,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適:前者可用多根超濾管同時超濾,降低濃度的辦法解決,后者的方法是換不同的Buffer,直到蛋白不發生沉淀為止。
            前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至lml左右的時候,輕輕加入新的Buffer(經0.22um超濾膜超濾),再濃縮至1ml左右,連續三次,后一
            次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定,-般不多于500u1,也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,三次達到1000倍以上,基本上可以達到換buffer的目的。
            取出蛋白濃縮液的操作在冰上操作,用黃槍頭取,輕輕順著邊緣插入槍頭,輕輕吹打、混勻蛋白液,注意不要碰到超濾膜,然后吸取濃縮液,每次吸接近200ul,直到吸完。管底剩下的后一點濃縮液不必吸取,否則難度太大,有可能損壞超濾膜。后加入MilliQ水到超濾管中,沒過超濾膜,防止膜失水變干。

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